細胞支原體污染的熒光檢測方法

DNA螢光染色法

· 原理︰利用螢光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測支原體污染。此染劑會結合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區域，因為支原體之DNA中A-T含量占多數（55～80%），所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細胞經染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。 

· 特點︰簡單、經濟與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟。可以偵測不易培養之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養法快，約一星期即可知道結果。 
· 缺點：有時仍會有螢光背景，影響判讀。 


步驟： 
· 取出培養之Vero細胞，吸除培養液。于每個well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液,用PBS洗滌三次。 
· 于每個well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置5-10 min。 
· 吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗滌3次，風干后加入1滴的封片劑，并以蓋玻片覆蓋之。 
· 以100x-400x螢光顯微鏡觀察。觀察細胞核外是否有藍色螢光小點或是絲狀點之螢光物產生。 
結果判讀︰
若有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點或是絲狀點。其形狀一致，與細胞殘片染成之不規則點狀物不同。其螢光可維持數星期。
圖例 (A)為negative result : 螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細胞的細胞核，測試樣品沒有支原體的污染。(為positive result : 在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點和絲狀點，表示測試樣品有支原體的污染。 
(A)Negative result 
螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細胞的細胞核，測試樣品沒有支原體的污染。 
 

(Positive Result 在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點和絲狀點，表示測試樣品有支原體的污染。