菌種保藏的基本方法

　　1、梭氏法

　　將容有1滴細胞懸液的小管﹐置于盛有氫氧化鉀或五氧化二磷吸水劑的大試管中﹐用真空泵抽至1、3帕時﹐將大試管密封保存。這是為減少細胞死亡率而采取的一種不經凍結﹑緩慢脫水的干燥保藏法﹐適用于多種細菌﹑真菌。

　　2、冷凍真空干燥法

　　將細胞懸液每0、1~0、2毫升注入一無菌安瓿瓶﹐于-40℃預凍1小時﹐再于-20~30℃﹑真空度為13、3帕的條件下脫水。在脫水過程后期﹐安瓿瓶外溫度可逐漸升至25℃。脫水后的樣品含水量應在3%以下。后﹐將安瓿瓶保持真空度1、3帕﹐用火焰溶封﹐置10℃保存。為防止細胞在凍結和脫水過程中損傷或死亡﹐要用保護劑制備細胞懸液。保護劑有脫脂牛奶﹑血清﹑10%蔗糖或葡萄糖溶液等﹐其作用是通過氧和離子鍵對水和細胞所產生的親合力來穩定細胞成分的構型。此法適用于病毒﹑衣原體﹑枝原體﹑細菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌等的長期保存﹐是當前保藏菌種的一個重要方法。但是﹐鹽桿菌﹑發光桿菌﹑黏桿菌﹑阿舒囊霉﹑多囊霉﹑擔子菌中的大多數屬種不適用于此法保存。

　　3、液態氮超低溫凍結法

　　用甘油或二甲亞(DMSO)作保護劑制備細胞懸液﹐分裝入無菌安瓿瓶﹐每管0、2毫升﹐在控制溫度下降速率為1℃/分鐘的條件下預凍至-40℃﹐然后立即放入液氮生物貯存罐中氣相(-150℃)保存。恢復培養時﹐先直接侵入38℃水浴中解凍5~10分鐘﹐再種植于適宜培養基內培養。這是根據在低于-130℃時一切生化反應處于停止狀態﹑微生物也不能進行代謝活動而設計的凍結法。為避免凍死﹑凍傷和細胞內形成大量冰晶﹐用保護劑制備懸液并控制預凍時的冷卻速率和解凍時融化速率。微生物的大多數屬種適于慢速凍結和快速解凍。此法適用于病毒﹑枝原體﹑各種細菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌﹑藍藻等。

　　4、定期移植法

　　將菌種接種于所要求的培養基上﹐在適溫度中培養﹐至靜止期或產生成熟的孢子時﹐置入5℃的冰箱(或冰庫)保存。在培養和保存的過程中﹐由于代謝產物的累積而改變了原菌的生活條件﹐結果菌落群體中的個體就不斷衰老和死亡﹐因此每5~15天或1~4個月重新移植一次﹐具體間隔時間因種而異。凡能人工培養的微生物都可用此法保存。此法不需特殊設備﹐但煩瑣﹐費時﹐而且經常移植容易引起菌種退化。

　　5、礦油封藏法

　　將化學純的液體石蠟(礦油)經高壓蒸氣滅菌﹐放在40℃恒溫箱中蒸發其中的水分﹐然后注入斜面培養物中﹐使液面高出斜面約1厘米。將試管直立﹐放在15~20℃室溫中保存。由于在斜面培養物上覆蓋一層液體﹐既能隔絕空氣﹐又能防止培養基因水分蒸發而干燥﹐可以延長菌種保藏的時間。但注入的液體必須不與培養基混溶﹑對菌種無毒﹐不易被利用和揮發。此法適用于酵母菌﹑芽孢桿菌﹔不適用于固氮菌﹑乳酸桿菌﹑明串珠菌﹑法門氏菌和毛霉目中的大多數屬種。此法簡便易行﹐但必須注意防火和污染。

　　6、沙土管法

　　將沙或土過篩﹑烘干﹑裝管﹑滅菌﹑然后將菌種制成孢子懸液滴入其中混勻﹐放到盛氯化鈣的干燥器里吸除水分﹐干燥后保存或用火焰封管后保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而處于休眠狀態﹐可保存較長時期。此法適用于芽孢桿菌﹑梭狀芽孢桿菌﹑放線菌﹑鐮刀菌等。

　　7、麩皮法

　　將麩皮制成培養基﹐培養要保存的菌種﹐待生長良好后﹐置干燥器中保存。這是根據中國釀造酒﹑醋﹑醬時制曲的經驗所采用的一種保藏方法﹐適用于谷物微生物區系中的種類。

　　8、L-干燥法

　　又稱液體干燥法或真空干燥法﹐用含3%谷氨酸鈉的0、1M磷酸緩沖溶液(pH7、0)做分散媒﹐將待保藏的微生物制成高濃度的細胞懸液﹐滴入無菌安瓿瓶中﹐每管0、05毫升﹔將安瓿瓶固定在多歧管上﹐并以水浴保持安瓿瓶內樣品溫度為10℃﹐在13、3~1、3帕的真空度下干燥﹐火焰封管保存。此法不經凍結﹐用真實泵迅速抽乾﹐可避免菌種的凍傷或死亡。廣泛應用于病毒﹑噬菌體﹑細菌﹑酵母菌﹑藍藻﹑原生動物等。