細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)時影響生長的幾點(diǎn)因素

　　細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng),失去了機(jī)體的調(diào)節(jié)和控制,因此,除滿足營養(yǎng)的要求外,還必須使細(xì)胞生存環(huán)境晝接近活體的環(huán)境.外環(huán)境的培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓、酸堿度等均能影響細(xì)胞的生長.

　　一、溫度：

　　一般哺乳類及禽類細(xì)胞體外培養(yǎng)的適宜溫度是37~38℃.溫度過高或過低都會影響到細(xì)胞的生長.細(xì)胞耐受低溫的能力比抗熱的能力強(qiáng),在低溫下,細(xì)胞的代謝活力及核分裂降低.溫度低于0℃時,雖影響細(xì)胞代謝,但并無傷害作用.把細(xì)胞置于23~25℃時,細(xì)胞仍能生存和生長,但速度減緩,不過,魚類細(xì)胞的適宜培養(yǎng)溫度為23~25℃.若溫度過低,在降到冰點(diǎn)以下時,細(xì)胞因胞外水和胞質(zhì)結(jié)冰而受損死亡,但若向培養(yǎng)基中加入甘油或二甲基亞砜（DMSO）等保護(hù)劑,封入安瓿中后,置于液氮或低溫冰箱（-70℃）中,可起保護(hù)作用,此時細(xì)胞可而耐受-70℃以下溫度,能長期儲存,解凍后細(xì)胞復(fù)蘇,仍能繼續(xù)生長增殖,細(xì)胞物性狀不受任何影響.此為保存細(xì)胞的主要手段.

　　高溫對細(xì)胞培養(yǎng)不利.細(xì)胞在39~40℃培養(yǎng)1h,會受到一定損傷,但仍有可能恢復(fù),但不能忍受溫度再升高2℃,持續(xù)數(shù)小時,即在41~42℃培養(yǎng)1h,細(xì)胞操作嚴(yán)重,溫度到43℃以上時細(xì)胞多數(shù)被殺死.高溫主要引起酶的滅活、類脂質(zhì)破壞、核分裂的破壞,產(chǎn)生凝固酶使細(xì)胞發(fā)生凝固,另外使蛋白質(zhì)變性.因此,體外培養(yǎng)細(xì)胞時一定要避免高溫.

　　二、滲透壓：

　　細(xì)胞在高滲透溶液中低滲溶液中,可以立即發(fā)生皺縮或腫脹、破裂.所以,滲透壓是體外細(xì)胞培養(yǎng)的重要條件之一.哺乳動物和其他動物組織細(xì)胞體外孫女培養(yǎng)的滲透壓的維持主要與NaCl有關(guān),但不能忽視其他電解質(zhì)與滲透壓的關(guān)系,滲透壓與單位體積溶劑內(nèi)溶質(zhì)的分子數(shù)和離子婁成正比.為此,按一定比例控制培養(yǎng)基中離子平衡,維持正常滲透壓是很重要的.這不僅是為了維持細(xì)胞張力,而且是為了調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝.因?yàn)榧?xì)胞外離子輸送和離子濃度改變著其他營養(yǎng)物質(zhì)的輸送（如氨基酸、糖等）,直接影響細(xì)胞基本合成系統(tǒng).

　　理想的滲透壓因細(xì)胞的類型及種族而異,人血漿滲透壓為290mmol/L,被視為是體外培養(yǎng)人類細(xì)胞的理想滲透壓.哺乳動物細(xì)胞的滲透壓一般為290~300mmol/L.人胚肺成纖維細(xì)胞為250~325mmol/L,鼠細(xì)胞則為310mmol/L左右.在實(shí)際應(yīng)用中,260~320mmol/L的滲透壓可適于大多數(shù)細(xì)胞.常用培養(yǎng)基的滲透壓值見表2-3.

　　三、氣體環(huán)境和PH值：

　　體外培植細(xì)胞需要理想的氣體環(huán)境,氧和二氧化碳石細(xì)胞生存必需的條件之一.

　　1、氧：

　　氧參加細(xì)胞的三羧酸循環(huán),產(chǎn)生能量以供應(yīng)給細(xì)胞生長、增殖和合成各種所需成分.有些細(xì)胞在低氧條件下,可借糖酵解取得能量,單多數(shù)細(xì)胞低氧時不能生存.氧張力通常維持在略低于大氣狀態(tài),若氧分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細(xì)胞有害.

　　2、二氧化碳：

　　采用開放式培養(yǎng)時（碟或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng)）,一般要把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳的混合氣體環(huán)境中.CO2既是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物,又是細(xì)胞生長所必需的成分,并與維持培養(yǎng)基的pH值有關(guān).在密閉瓶中CO2濃度偏低的情況下,細(xì)胞容易生長,一般不能低于1%,否則有損細(xì)胞.CO2增加將使pH值下降.

　　3、pH值：

　　大多數(shù)細(xì)胞適于在pH7.2~7.4條件下生長,低于pH6.8或高于pH7.6對細(xì)胞有害,甚至退變或死亡各種細(xì)胞對pH值的要求不盡相同.一般原代培養(yǎng)細(xì)胞對pH值的堿性的耐受比對酸性的耐受差,偏酸的環(huán)境比偏堿的環(huán)境對細(xì)胞生長有利.為了維持培養(yǎng)環(huán)境恒定的pH值,多采用在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑的方法.磷酸緩沖劑中的NaHCO3可供給CO2,但CO2易于逸出,故只適用于封閉式培養(yǎng).若開放式培養(yǎng)還是置于含有5%CO2的氣體環(huán)境中為宜.為克服NaHCO3調(diào)整的麻煩,也可用羧基哌唪硫磺酸（N-2 –hydroxyethyl piperazine-N’ethanesulfonic acid,Hepes）,它對細(xì)胞無毒性,主要作用是防止pH值迅速變動,在開瓶通氣培養(yǎng)或活細(xì)胞觀察時能維持較恒定的pH值.

　　四、無毒和無菌：

　　無毒和無菌是體外培養(yǎng)細(xì)胞的首要環(huán)境條件.細(xì)胞在深入活體內(nèi),偶爾有**或有害物質(zhì)入侵,因體內(nèi)有強(qiáng)大的**系統(tǒng)和**系統(tǒng),可將其**或**,而不易受損害.但在離體的環(huán)境中,失去了防御系統(tǒng),一旦有害物質(zhì)入侵或**污染,可導(dǎo)致細(xì)胞死亡,前功盡棄.如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、支持物、培養(yǎng)基、瓶塞上有細(xì)胞毒性,在培養(yǎng)過程中可導(dǎo)致細(xì)胞死亡因此,在選用這些器皿、材料時要注意,若這些物品**不*,帶菌或操作過程不小心使細(xì)胞污染,也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡.若出現(xiàn)交叉污染,可使實(shí)驗(yàn)室原來的細(xì)胞系失去原有特性,應(yīng)引起足夠的重視.

　　五、輻射線和超聲波：

　　1、可見光

　　可見光的波長是390~780nm.可見光的各種有色光能引起細(xì)胞退變,延長核分裂的間期,還可顯著降低細(xì)胞的附壁能力.因此,體外培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)避免日光直接照射,*好在黑暗中進(jìn)行培養(yǎng)或短期存放.

　　2、紫外線

　　弱紫外線下耐受能力強(qiáng)的細(xì)胞變化不大,但對敏感的細(xì)胞有損害.紫外線強(qiáng)時,就分離的細(xì)胞顯示：不能進(jìn)行*的有絲分裂；在有絲分裂時增加了脫水收縮；在有絲分裂時細(xì)胞質(zhì)的起泡減少.Elrlich腹水癌細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后,用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)被照射表面形成水泡,隨后細(xì)胞膨脹,損害也漸變嚴(yán)重.

　　3、放射線

　　X射線對細(xì)胞有明顯損傷.B射線可影響細(xì)胞核的分裂.R射線使核分裂數(shù)減少并出現(xiàn)不正常的核分裂,可使細(xì)胞死亡.

　　4、超聲波

　　在超聲波振動下,細(xì)胞很快會破裂,開始是胞質(zhì)發(fā)生紊亂的流動,原生質(zhì)膠體結(jié)構(gòu)也有明顯變化,若停止超聲波振動可恢復(fù).細(xì)胞致死的原因是由于產(chǎn)生空化作用所致.當(dāng)超聲波在2.5W/c㎡時,細(xì)胞受損,染色體發(fā)生畸變,首先發(fā)生畸變的是核染色體.

　　六、細(xì)胞接種密度：

　　在體外培養(yǎng)細(xì)胞中,細(xì)胞接種數(shù)對細(xì)胞的生長有影響,適宜的接種密度,可以促使細(xì)胞增殖,接種密度太低或太高都不利于細(xì)胞的生長增殖.如果培養(yǎng)基與細(xì)胞的容積比例大于2000：1,生長物質(zhì)彌散到細(xì)胞外過多,將使細(xì)胞內(nèi)濃度低于*小限度的濃度,此時細(xì)胞不能再增殖,培養(yǎng)基的pH值變堿,抑制細(xì)胞生長,細(xì)胞變圓不能貼壁,甚至引起細(xì)胞死亡等.如果接種密度太高,每個細(xì)胞周圍培養(yǎng)基的容積降至0.007㎜3以下,由于彌散率降低,細(xì)胞內(nèi)生物質(zhì)的濃度增加,容易使排出物或其他代謝產(chǎn)物達(dá)到飽和,能量來源也很快耗盡,因此也會防礙細(xì)胞的增殖.

　　如何選擇適宜的接種濃度要根據(jù)細(xì)胞的代謝和生長繁殖速度以及工作的需要而確定.一般來說,代謝旺盛、生長速度快的細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）,接種濃度宜偏低；而正常組織細(xì)胞生長較慢,代謝不夠旺盛,接種濃度可偏高；如果是為了保種或不需急用,接種可偏低些；有時為了便于觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu),接種濃度也可適當(dāng)降低.

　　七、容器轉(zhuǎn)動速度和懸浮攪動速度：

　　有時為了研究的需要而將培養(yǎng)細(xì)胞在容器中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)或攪動,如貼壁細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)管中培養(yǎng),使轉(zhuǎn)鼓的轉(zhuǎn)速提高,細(xì)胞增殖率隨之提高.其原因可能是轉(zhuǎn)動使足夠的營養(yǎng)物質(zhì)流動和較充分的氧化作用之故.

　　當(dāng)懸浮攪拌培養(yǎng)細(xì)胞時,攪拌速度既不能太快,也不能太慢.如果太慢,細(xì)胞易結(jié)團(tuán)、下沉和貼壁,不利于細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下增殖.如果太快,容易起泡沫,細(xì)胞易窒息致死,同時,強(qiáng)烈地?cái)噭右资辜?xì)胞因機(jī)械損傷而破裂.所以選擇適宜的攪拌速度很重要.如BHK-21細(xì)胞的攪拌適宜速度為460～330r/min；**細(xì)胞（Raji細(xì)胞）株,在200r/min和400r/min（Namalva細(xì)胞）生長速度快,在80～1000r/min時既不結(jié)團(tuán),又不需要加抗泡沫劑,細(xì)胞生長仍然很快.各種細(xì)胞的適宜攪拌速度不一致,通常與細(xì)胞的特性和質(zhì)量有關(guān),應(yīng)予以注意.